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透析膜的透析方法

2018-05-10      887

自上世紀50年代起,透析就已經成為生命科學實驗室分離生物大分子複合物的常用技術,雖然在很長一段時間内,由于超濾及離心技術的推廣,透析技術并沒有得到很大的改進,特别是傳統透析方式由于操作繁瑣,耗時等原因,會有不小的困擾。但現在,spectrumlabs推出了新一代即用型生物技術級透析裝置,使透析這項傳統的基礎實驗技術,在使用的簡便性和實用性方面得到了長足的進步。
 

透析是根據半透膜對大、小分子不同尺寸的選擇性擴散過程,實現分離的技術。常見的蛋白質或核酸樣品中,常會含有不需要的小分子物質,如緩沖鹽溶液(Tris、PBS)、還原劑(二硫蘇糖醇DTT、β-巯基乙醇BME)或保存劑(醫用酒精、抗菌劑)等。

 

将樣品置于透析膜内,透析液置于透析膜外(一般為樣品體積的200-300倍),使膜兩側形成濃度梯度,分子會從膜一側擴散通過膜進入另一側,并zui終達到平衡。一旦達到平衡,透析(擴散)停止。通常情況下,接近平衡狀态時,擴散速率會降低,所以每隔一段時間需要更換透析液,以維持濃度梯度,驅動透析過程進行。

膜的選擇是透析成功的關鍵。半透膜的孔徑需足夠大,以使小分子物質通過,但同時又需足夠“小”,以限制大分子物質。理想的透析膜需很“薄”、具有大小均一的膜孔、且不結合蛋白質或核酸。常見的再生纖維素或纖維素酯即是較為理想的透析膜材質選擇。

 

另一個影響透析膜選擇的重要參數是截留分子量(MWCO),我們将其定義為膜截留率至少為90%的分子的分子量。但在實際操作中,分子通過膜的擴散過程還受到分子形狀、水合程度、離子電荷及極性等因素的影響,所以需做綜合測試及評估。

 

樣品和透析液的體積也是需要考慮的重要參數,理想的情況是較小的樣品體積使用較大的透析液體積,以使濃度梯度zui大化。需要考慮樣品體積是因為透析後樣品的處理或應用通常具有一定的zui小體積要求。但是隻要能滿足zui小體積要求,一般不推薦透析過多的樣品。因為基于給定樣品的膜表面積,小體積樣品的透析速率比大體積樣品要快得多。此外,樣品與固相界面接觸的時間越長,樣品損失的可能性越高,蛋白質或核酸發生非特異性結合或變性的幾率越大。

其它問題關注
 

1)   膜的留分子量(MWCO)到底有多?

 MWCO可以作為衡量膜截留性能的指标,但MWCO并不是的、的數值,所以選擇膜MWCO時,建議根據需要截留的大分子物質和需要擴散去除的小分子物質,對不同MWCO的膜進行測試,一般推薦膜MWCO為需截留物質分子量的50-80%,同時需至少為需去除物質分子量的100倍。

 

早期的透析膜産品因為生産技術及質控的原因,MWCO一般控制在2kD-20kD以内,經過技術革新,現在我們可提供截留分子量範圍更廣的透析膜産品,低至0.1kD,高可達1,000kD。每種規格的透析膜均具有特定的截留性能,可使用已知分子量的物質對MWCO進行檢測。

 

2)  透析時一定要攪拌嗎?
 

攪拌可顯著縮短透析時間。所有的膜都具有内表面和外表面,從膜的樣品一側到透析液一側并沒有固定直徑的通道,相反,樣品中的小分子量物質擴散進入内表面的膜孔,然後通過膜内部,再從膜外表面的膜孔透出,進入膜外擴散層“微環境”,擴散層内小分子物質的濃度顯著高于透析液的其它位置。攪拌可快速、有效地打破擴散層微環境,維持濃度梯度,保證透析進行。

 

3)  透析溫度應如何把握?
 

溫度對透析的進行也有一定程度地影響,因為分子在較高的溫度下會更快地移動擴散,但前提是操作溫度不影響産品的活性。所以,除特殊樣品外,一般在環境溫度或室溫下進行即可。

 

4)  怎樣判定透析已經結束?
 

判定透析結束并沒有簡單、的标準。一般來說,隻要樣品中的小分子含量降低到不影響後續實驗即可認為透析完成。

 

5)  需要對膜進行預處理嗎?
 

spectrumlabs透析膜出廠前已經預處理。部分規格的膜産品可能含有少量的甘油或硫化物,正常情況下,這些小分子在透析過程中即可自動擴散去除。如處理的樣品較為敏感,也可在使用前用超純水對膜進行預沖洗,對于在膜生産過程中可能存在的痕量重金屬,可使用重金屬漂洗液去除。

 

Spectra/Por Float-A-Lyzer G2即用型透析裝置(CE膜)采用預制型膜管,極大地提高了樣品/膜比表面積,可顯著縮短分子的遷移距離,使透析速率更快。同時Spectra/Por Micro Float-A-Lyzer微量即用型透析裝置可處理低至100μl的樣品,如使用較大量的透析液,維持高濃度梯度,即可得到極高的透析速率。