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密理博超濾離心管的常見問題與解答

2018-05-25      2507

密理博超濾離心管的常見問題與解答:

一:超濾離心管的膜材質是什麼?

密理博超濾離心管的膜材質為默克密理博特有的Ultracel再生纖維素膜,生産工藝嚴格,截留分子量明确而,蛋白吸附損失zui小。

二:如果要用超濾離心管的方法分離兩種蛋白,那麼這兩個蛋白的大小需要相差多少?

按照經驗,建議兩個蛋白的分子量要相差一個數量級(10倍)

三:密理博超濾離心管可以用于病毒濃縮嗎?

可以。對于慢病毒推薦Amicon Ultra 100KDa;對于腺病毒推薦Amicon Ultra 50KDa。具體的操作步驟可以參考病毒濃縮純化試劑盒FTLV00003和 FTAV00003的産品使用說明書。

四:密理博超濾裝置是否可以用于高壓滅菌?

Amicon Ultra都是采用熱封設計,不可以用于高壓高溫滅菌。

五:超濾離心管可以用酒精消毒滅菌嗎?

Amicon Ultra與70%乙醇是兼容的中,但是對滅菌處理的具體方法沒有做相關的測試,所以無法提供更進一步的參考信息。

六:超濾離心管含不含RNA酶?

不保證超濾離心管不包含RNA酶,建議用0.1%DEPC在37度浸泡2小時,以完全滅活RNA酶;殘留的DEPC可以用Milli-Q超純水洗滌除去。

七:用超濾離心管去除去污劑是有什麼需要注意的嗎?

去污劑因其獨特的性質,當濃度大于臨界微團濃度(Critical Micelle Concentration、CMC)時,去污劑分子會聚集形成微團而改變分子構象,這有可能會影響去污劑的去除效果,具體的操作步驟請垂詢默克密理博。

八:蛋白在濃縮時出現了沉澱,如何改進?

蛋白濃縮過快或者過度濃縮都有可能引起蛋白沉澱。建議蛋白濃縮後的zui終濃度不超過20mg/ml。對于對濃縮速度敏感而容易沉澱的蛋白,建議的方法是1)離心力降為推薦離心力的30%-50% 2)改用截留分子量更大的超濾管(如原本選用10K,此時可以選擇30K) 3)在濃縮過程中取出超濾管,用槍頭反複吹吸幾次後再繼續濃縮。

九:濃縮後發現濃縮液中沒有目的蛋白,可能的原因有哪些?

首先,Amicon Ultra超濾管的蛋白zui低起始濃度為25ug/ml。請确保樣本的起始濃度大于這個濃度。其次,如果問題仍然出現,請不要丢棄樣本濾過液以便用于分析可能的原因:

1)如果目的樣本在過濾液中,那麼請排查 :a)是否選擇了合适截留分子量的超濾管(目的蛋白分子量的1/2或者1/3) b)使用的離心力是否在限定範圍内?如果使用的是rpm,請換算成相應的g離心力。c)離心機zui近是否有校準過?d)是否嘗試這個蛋白?如果能确保用同樣的超濾管對其它蛋白成功操作的話,那麼有可能是這個目的蛋白的原因。有時蛋白會因其本身的一些特性(構象差異)而影響濃縮效果,建議選用上一分子量級别的超濾管(如原本選用30K,此時可以選擇10K)。

2)如果目的樣本也不在濾過液中,那麼:a)蛋白樣本起始濃度是否大于25ug/ml?b)用來确定樣本濃度的方法是什麼?是否可信? c)目的蛋白是不是沉澱了?如果是,具體解決方法請參考上面的關于蛋白沉澱問題的解釋。

十:有時候用超濾離心管連水都離不下來,可能是什麼原因?

超濾離心管超濾膜中含有微量甘油。如果出現這種情況,請先用0.1N NaOH清洗再離心。zui後用緩沖液或Milli-Q水再次清洗後甩幹。清洗後的濾膜應立即使用,如暫時不用,請保持潤濕狀态,避免重新幹燥。

十一:說明書推薦在室溫下進行離心,考慮到蛋白的穩定性,是否可以在4 攝氏度進行離心?

可以,但是低溫會增加蛋白樣品的粘性,導緻流速減慢,建議可将離心時間延長到原來的1.5倍。

十二:如何對超濾離心管進行去除内毒素的處理?

提供的超濾離心管是沒有經過去内毒素處理的,同時由于内毒素通常以多聚體的形式存在,大小在10-1000KD之間不等,在超濾的過程中是無法去除的。可以實驗前通過先用0.5M NaOH預清洗,随後用Milli-Q水/緩沖液清洗的步驟去除大部分内毒素。關于針對Amicon Microcon Centricon嘗試過的内毒素去除方案,請垂詢默克密理博技術。

十三:用濃縮後的蛋白做下遊分析時發現有幹擾,可能有哪些原因?

密理博超濾膜含有微量甘油。如果此成分幹擾分析,可用緩沖液或Milli-Q水預清洗。如果幹擾仍存在,用0.1N NaOH清洗,然後用緩沖液或Milli-Q水再次清洗後甩幹。

十四:懷疑濃縮過程中目的蛋白和超濾膜之間可能存在非特異性吸附,如何改善?

密理博超濾離心管使用的是再生纖維素膜,這種材質是蛋白吸附zui低的超濾膜。但是對于一些疏水性蛋白或非極性蛋白,它們和膜的非特異吸附可能會增強,對于這種情況,可以嘗試在實驗前對超濾管進行封閉處理,也可以嘗試換成Amicon Ultra0.5或2來進行實驗,通過減小膜面積來降低非特異性吸附。