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人外周血淋巴細胞分離液步驟

2016-11-14      點擊:791
  人外周血淋巴細胞分離液步驟,将采到的肝素抗凝血取樣計數白細胞總數.使用Hank’s液/PBS液/無血清RPMI1640将血樣1:1稀釋,混勻時要沿管壁吹出,避免産生氣泡。吹勻後于37℃水浴中平衡.從冰箱中取出4℃避光保存的淋巴細胞分離液。搖勻後在無菌狀态下加入刻度離心管中。操作中盡量避免吸管碰觸管壁。原則上分離液的高度不超過管高的1/4.将盛有分離液的離心管放入37℃水浴中平衡.用吸管将稀釋的血液沿離心管壁徐徐加到分離液面上,用力要輕,避免血液沖入分離液中,使得稀釋血重疊在分離液面以上,擰緊管蓋。稀釋血與分離液的高度比在1:2-2:1之間。原則上兩者的總高度不超過離心管的2/3。
  人外周血淋巴細胞分離液将離心管放置于水平離心機中,室溫下 2000rpm離心20min。離心過程中要觀察離心速度是否正确,且在停止時選擇“no break”,避免因為急劇減速将已經分離的單個核細胞層重新弄混。注意離心結束時的減速過程,不要太快.離心結束後可見管内分為四層,從上至下分别為:血漿層(含部分血小闆)、白膜層(含單個核細胞及少量血小闆)、分離液層、粒細胞及紅細胞層。将吸管輕輕穿過血漿層至白膜層,沿離心管周緣吸出血漿層與分離液層界面間的白膜層細胞,置于新離心管中。盡量少吸取分離液。
  人外周血淋巴細胞分離液zui後一次離心完畢傾倒出上清液後請要度離心管,将管底細胞搖勻。根據上一步的計數結果,用含FBS10%-20%、雙抗的RPMI1640培養液将細胞配成所需濃度.核心技術,如實陳述.